国自然两大明星circRNA和自噬在一起了
自噬是近年来十分热门的领域，2016年的诺贝尔生理学或医学奖授予日本科学家大隅良典，因为这位科学家发现了细胞自噬的机制。
在近几年的国自然研究中，关于自噬的研究越来越热门，据不完全统计，2017年国自然面上项目中有关自噬的项目数已超200项，项目金额已超1300万；而与circRNA相关的项目数已超100项，项目金额已超5100万。
今天我们一起来看一篇最新的论文，发表在知名期刊《Autophagy》上，介绍circRNA携手自噬调控星形胶质细胞活化的机制研究。
题目：circHIPK2以MIR124-2HG为靶点联合自噬及内质网应激以调控星形胶质细胞活化
Circular RNA HIPK2 regulates astrocyte activation via cooperation of autophagy and ER stress by targeting MIR124-2HG
年份：2017
期刊：Autophagy
IF：8.593
机构：东南大学
1.本文思路与结论
circRNA（circular RNAs）是哺乳动物细胞中的一类非编码RNA，近年来的研究越来越受关注，但是circRNA是否参与星形胶质细胞活化仍然未知。本文作者在前期研究中发现SIGMAR1在甲基苯丙胺（冰毒的一种主要成份）诱导的星形胶质细胞活化中表达上调并在星形胶质细胞活化过程中发挥重要的作用。本文正是以此为出发点进行研究的。作者研究了circHIPK2作为miRNA海绵结合并抑制miR124-2HG活性，进而增加σ非阿片受体（SIGMAR1/OPRS1）的表达。在体内和体外两个水平上敲减circHIPK2后可通过靶向miR124-2HG及SIGMAR1调控细胞自噬及内质网应激进而明显抑制星形胶质细胞的激活。本文示意图如下：
2.miR124-2HG在转录后水平调节星形胶质细胞中SIGMAR1的表达
首先通过生物信息学预测miR124-2HG可能调控SIGMAR1的表达，然后通过luciferase实验、RT-PCR、Western Blot等发现miR124-2HG在转录后水平调节星形胶质细胞中SIGMAR1的表达（图1A，B，G，H，I，J）。另外发现甲基苯丙胺处理星形胶质细胞后miR124-2HG表达下降，SIGMAR1表达升高（图1C，D，E，F）。
图1 miR124-2HG在转录后水平调节星形胶质细胞中SIGMAR1的表达
3.miR124-2HG通过靶向SIGMAR1抑制星形胶质细胞活化
作者通过体内（左）和体外（右）实验证实miR124-2HG通过靶向SIGMAR1抑制甲基苯丙胺诱导的星形胶质细胞活化。胶质纤维酸性蛋白(GFAP)是星形胶质细胞的特异性标志物，当星形胶质细胞活化后会产生GFAP并释放到胞外。转染miR124-2HG会抑制甲基苯丙胺诱导的星形胶质细胞活化，转染miR124-2HG抑制物会促进甲基苯丙胺诱导的星形胶质细胞活化，而同时转染SIGMAR1 siRNA会抵消这种促进作用。体内实验是通过显微注射Anti-MIR124-2HG-RFP慢病毒或对照病毒进入野生型和SIGMAR1敲除的小鼠海马体实现的。
图2 miR124-2HG通过靶向SIGMAR1抑制星形胶质细胞活化
4.circHIPK2与miR124-2HG结合
在http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/rnahy brid上预测miR124-2HG结合的circRNA，发现circHIPK2上存在一个miR124-2HG结合位点。然后通过荧光原位杂交实验证实circHIPK2在小鼠星形胶质细胞中表达（图3B），通过RT-PCR和qRT-PCR实验发现星形胶质细胞激活过程中circHIPK2表达升高（图3C，D），通过pull-down及荧光原位杂交实验证实circHIPK2可以与miR124-2HG结合（图3E，F）。
图3 circHIPK2与miR124-2HG结合
5.敲降circHIPK2抑制星形胶质细胞活化
通过Western Blot实验证实敲降circHIPK2能够抑制星形胶质细胞活化并显著减弱甲基苯丙胺诱导的SIGMAR1表达，而且敲降circHIPK2能够抵消miR124-2HG抑制物对星形胶质细胞活化及SIGMAR1表达的诱导作用（图4）。体内实验是通过显微注射circHIPK2 siRNA慢病毒进行验证的（图5）。
图4 敲降circHIPK2通过miR124-2HG抑制星形胶质细胞活化（体外）
图5 敲降circHIPK2抑制星形胶质细胞活化（体内）
6.敲降circHIPK2通过miR124-2HG抑制星形胶质细胞自噬
甲基苯丙胺处理星形胶质细胞后发现ATG5 和 BECN1以及MAP1LC3B-II表达升高，说明甲基苯丙胺能够诱导星形胶质细胞自噬（MAP1LC3B-II是细胞自噬的marker）。小鼠原代星形胶质细胞（图6B）和免疫荧光的结果（图6C、5E）以及电镜结果（图6D）证实了该结论。进一步研究发现敲降circHIPK2能够抑制甲基苯丙胺诱导的星形胶质细胞自噬并且这种抑制作用是通过miR124-2HG实现的（图7）。
图6 甲基苯丙胺能够诱导星形胶质细胞自噬
图7 敲降circHIPK2通过miR124-2HG抑制星形胶质细胞自噬
7.敲降circHIPK2通过miR124-2HG抑制星形胶质细胞内质网应激
进一步研究发现，敲降circHIPK2能显著抑制甲基苯丙胺诱导的星形胶质细胞内质网应激并且这种抑制作用是通过miR124-2HG和SIGMAR1实现的（图8）。（DDIT3可以看作是内质网应激的marker）
图8 敲降circHIPK2通过miR124-2HG抑制星形胶质细胞内质网应激
8.自噬和内质网应激在甲基苯丙胺诱导的星形胶质细胞活化中的作用
前面的研究提到甲基苯丙胺能够诱导的星形胶质细胞活化并且诱导细胞发生自噬和内质网应激，接下来，作者研究了自噬和内质网应激在甲基苯丙胺诱导的星形胶质细胞活化中的作用，结果发现用内质网应激的抑制剂salubrinal（Salubrinal是一种选择性eIF2α去磷酸化抑制剂）处理细胞后显著减弱甲基苯丙胺诱导的星形胶质细胞活化（图9），另外，用细胞自噬抑制剂3-methyladenine处理细胞显著增强甲基苯丙胺诱导的星形胶质细胞活化，相反用自噬促进剂rapamycin（雷帕霉素）处理细胞显著减弱甲基苯丙胺诱导的星形胶质细胞活化（图9）。这些结果表明自噬抑制星形胶质细胞活化。
图9 自噬和内质网应激在甲基苯丙胺诱导的星形胶质细胞活化中的作用
9.甲基苯丙胺诱导的细胞自噬和内质网应激的相互作用
进一步研究发现内质网应激的抑制剂salubrinal处理细胞后能够抵消甲基苯丙胺诱导的星形胶质细胞细胞自噬，另外，自噬促进剂rapamycin处理细胞能够抵消甲基苯丙胺诱导的星形胶质细胞细胞内质网应激，相反，自噬抑制剂3-methyladenine处理细胞能够促进甲基苯丙胺诱导的星形胶质细胞细胞内质网应激（图10）。这些结果表明甲基苯丙胺诱导的细胞自噬和内质网应激存在相互作用。
图10 甲基苯丙胺诱导的细胞自噬和内质网应激的相互作用
10.亮点解读
本文首先证实miR124-2HG能够调节SIGMAR1表达，而前期研究发现SIGMAR1在星形胶质细胞活化中发挥重要的作用，顺理成章研究了miR124-2HG在星形胶质细胞活化中的作用，结果发现在体内和体外miR124-2HG均能够通过SIGMAR1抑制星形胶质细胞活化。接下来就是我们的circRNA登场，通过生物信息学发现circHIPK2可能结合miR124-2HG，后续通过实验加以证实。敲降circHIPK2能够通过miR124-2HG抑制星形胶质细胞活化。另外，敲降circHIPK2能够通过miR124-2HG抑制星形胶质细胞自噬和内质网应激，并且甲基苯丙胺诱导的细胞自噬和内质网应激存在相互作用。最终证明circHIPK2通过靶向miR124-2HG联合自噬和内质网应激调控星形胶质细胞活化并且该发现在药物滥用及神经炎症疾病中有潜在的应用价值。
上述解读转载自“circRNA”微信公众号，作者：午言
参考文献
Huang, R., et al., Circular RNA HIPK2 regulates astrocyte activation via cooperation of autophagy and ER stress by targeting MIR124-2HG. Autophagy. 2017 Aug 8:0. doi: 10.1080/1554862 7.2017. 1356975. [Epub ahead of print]
文章读完了，是不是还有点懵
小编已经为你准备好相关的背景资料
用户近期发表的circRNA文章